一、原理：

ncRNA在細(xì)胞中往往通過sponge機制吸附miRNA，進(jìn)而影響miRNA靶基因（mRNA）的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能，因此在細(xì)胞水平驗證ncRNA-miRNA-mRNA相互作用就成了ncRNA研究的重要內(nèi)容，非常適合lncRNA、circRNA相關(guān)機制研究。

二、研究路線：

1. 通過靶向RNA回收技術(shù)回收到ncRNA結(jié)合的miRNA；

2. 通過miRNA pulldown技術(shù)回收到miRNA的靶基因；

3. 通過熒光素酶報告檢測驗證miRNA和ncRNA，miRNA和靶基因在細(xì)胞中有相互作用；

4. 通過RNA FISH技術(shù)確定miRNA和ncRNA在細(xì)胞存在共定位；

5. 通過Ago蛋白IP驗證miRNA以Ago蛋白復(fù)合物的形式和ncRNA在細(xì)胞中相互作用；

三、舉例說明解決方案服務(wù)內(nèi)容：

1. 靶向RNA回收技術(shù)

目的：通過靶向RNA回收技術(shù)回收鑒定ncRNA結(jié)合的miRNA

圖例：細(xì)胞中ncRNA到底和那些miRNA結(jié)合可以采用軟件預(yù)測和實驗方法進(jìn)行預(yù)測和鑒定，但是軟件預(yù)測往往不準(zhǔn)，所以采用實驗方式是一種有效的方式。圖中實驗設(shè)計探針靶向回收p21 mRNA，然后通過miRNA qPCR芯片檢測p21 mRNA結(jié)合的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一條不能被軟件預(yù)測到的miRNA(miR-92a)和p21 mRNA結(jié)合。

圖參考文獻(xiàn)：Su X,et,al. An In Vivo Method to Identify microRNA Targets Not Predicted by Computation Algorithms: p21 Targeting by miR-92a in Cancer. Cancer Research. 2015; 75(14): 2875-85。

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2. miRNA pulldown技術(shù)

目的：通過生物素標(biāo)記miRNA回收鑒定靶基因 (mRNA)

圖例：可以通過軟件預(yù)測和實驗方式進(jìn)行miRNA靶基因的尋找，但是軟件預(yù)測往往不準(zhǔn)，所以采用實驗方式是一種有效的方式。圖中實驗設(shè)計生物素標(biāo)記的miR-10a，轉(zhuǎn)入細(xì)胞讓其與靶基因結(jié)合，然后通過磁珠回收其結(jié)合的靶基因，通過測序來鑒定其靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-10a與多種mRNA在細(xì)胞中結(jié)合。

圖參考文獻(xiàn)：Orom, U. A., Nielsen, F. C., & Lund, A. H. (2008). MicroRNA-10a binds the 5′UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation. Molecular Cell,?30, 460–471.

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3. 熒光素酶報告基因檢測：

目的：驗證ncRNA與miRNA，miRNA與mRNA的相互作用

圖例：ncRNA在細(xì)胞中是否通過吸附miRNA進(jìn)而介導(dǎo)對miRNA靶基因的功能調(diào)控，通過分別進(jìn)行熒光報告基因檢測可以得到證明。圖中實驗分別構(gòu)建包含ncRNA（has_circ_0010729）和靶基因（HIF-1a）野生型（Wild type）和突變型（Mutant）結(jié)合位點的熒光報告基因表達(dá)載體，然后在細(xì)胞中檢測miRNA(miR-186)對其表達(dá)的影響，結(jié)果顯示對于包含野生型結(jié)合位點的報告基因表達(dá)載體，miR-186能抑制其表達(dá)，而對于包含突變型結(jié)合位點的報告基因表達(dá)載體，miR-186不能影響其表達(dá)，該結(jié)果說明miR-186在細(xì)胞中分別可以結(jié)合has_circ_0010729和HIF-1a，并且有調(diào)控作用。

圖參考文獻(xiàn)：Dang RY, Liu FL, Li Y. Circular RNA hsa_circ_0010729 regulates vascular endothelial cell proliferation and apoptosis by targeting the miR-186/HIF-1alpha axis. Biochem Biophys Res Commun. 2017;490:104–10.

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4. RNA FISH

目的：驗證ncRNA和miRNA在細(xì)胞中共定位

圖例：如果ncRNA通過吸附miRNA起作用，那么在細(xì)胞中兩者應(yīng)該具有共定位在一起的特征。圖中實驗分別設(shè)計合成ncRNA（cSMARCA5）和miRNA(miR-17-3p) RNA FISH探針，在細(xì)胞中分別進(jìn)行RNA FISh檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cSMARCA5和miR-17-3p都位于細(xì)胞漿中，并且顯示兩者具有共定位的特征，證明在細(xì)胞中circHIP3能吸附miR-29a。

圖參考文獻(xiàn)：Yu J et al. Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma. J Hepatol (2018).

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5．AGO2 RNA免疫共沉淀

目的：證實miRNA以Ago蛋白復(fù)合物的形式和ncRNA結(jié)合在一起

圖例：細(xì)胞中miRNA經(jīng)常與Ago蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)而參與靶基因的結(jié)合和調(diào)控，因此證實ncRNA和miRNA都位于Ago蛋白復(fù)合物中能進(jìn)一步證實ncRNA是通過吸附miRNA起作用的。圖中實驗采用Ago2蛋白抗體進(jìn)行RIP回收，然后通過PCR檢測回收結(jié)果中ncRNA（circHIP3）和miRNA(miR-29a)的含量,結(jié)果證實兩者都出現(xiàn)在Ago2蛋白復(fù)合物中，進(jìn)一步證明circHIP3可以吸附miR-29a起作用。

圖參考文獻(xiàn)： Zhong Z, Huang M, Lv M, He Y, Duan C, Zhang L, Chen J. Circular RNA MYLK as a competing endogenous RNA promotes bladder cancer progression through modulating VEGFA/VEGFR2 signaling pathway. Cancer Lett. 2017 Sep 10;403:305-317.

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四、最后得到的模式圖如下：

ncRNA（比如circHIPK3）通過sponge作用吸附miRNA(比如miR-29a)，進(jìn)而影響miR-92a的靶基因（比如VEGF-A），進(jìn)而影響細(xì)胞的功能，至此ncRNA的作用機制就非常清楚了。